简介
为解决广藿香抗性下降、资源短缺的现状,以广藿香原生质体对称融合的多倍体育种方法改良品种,期望在提高石牌广藿香有效成分及产量的基础上避免化学诱导多倍体带来的嵌合体缺陷。 以根尖为外植体获得愈伤组织:以MS培养基为基础,在光照14h/d,25±2℃,MS + 2,4-D(0.05 mg/L)+ KT(0.5 mg/L)培养基,愈伤组织诱导率最高,为87.5%,多次继代后可获得白色或黄白色疏松愈伤组织。经悬浮培养得到悬浮细胞,以9-15 d处于对数生长期的悬浮细胞为原材料,混合酶液选用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶,在最佳酶液组合为1.5%纤维素酶、0.8%果胶酶和0.5%半纤维素酶,最佳渗透压调节剂甘露醇的浓度为0.4 mol/L条件下,酶液渗透势以0.4 moL/L甘露醇调节,pH设为5.8,温度25℃,以50rpm避光振荡酶解12 h,获得原生质体;考察PEG浓度、融合时间、融合密度、融合液加入量对融合的影响。最终确定选用40%的PEG 6000进行化学促融30 min,融合液加入量为原生质体悬浮液体积的0.5倍,融合密度2.0×105 个/mL,聚合率57.19%,融合产物以铵盐减半的MS1培养基进行海藻酸钠包埋,激素选用0.2 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA,培养密度为2.0×105 个/mL,蔗糖添加量1.0%,酸水解酪蛋白500mg/L。在培养第6天观察到细胞第一次分裂,14天左右细胞开始大量分裂,分裂频率为6.91%,第16天形成细胞团,植板率为1.83%,培养第63天左右观察到肉眼可见愈伤组织。